Таҳрири Питер Сарнов, Мактаби тиббии Донишгоҳи Стэнфорд, Донишгоҳи Стэнфорд, Калифорния, 25 декабри соли 2020 тасдиқ шудааст (25 октябри соли 2020 баррасӣ шудааст)
Мо дар бораи таъсири мутақобилаи зерқисмҳо дар репликатсияи комплексҳои транскрипсияи коронавирусҳо гузориш медиҳем, ки барои такрорӣ ва ҳифзи эволютсионӣ муҳиманд.Мо далелҳо пешниҳод кардем, ки домени NiRAN, ки бо nsp12 алоқаманд аст, дорои фаъолияти трансферазаи нуклеозидмонофосфат (NMP) дар транс ва nsp9 (протеини ҳатмии РНК) ҳамчун ҳадафи он муайян карда шуд.NiRAN пайвасти ковалентии қисми NMP-ро ба терминали аминокислота nsp9 дар реаксияе катализ мекунад, ки ба ионҳои Mn2+ ва пасмондаҳои Asn-и ҳамшафат такя мекунад.Муайян карда шуд, ки фаъолияти NiRAN ва nsp9 NMPylation барои такрори коронавирус муҳиманд.Маълумот ба мо имкон медиҳад, ки ин фаъолияти маркери ферментҳои лонашудаи вирусро бо мушоҳидаҳои қаблӣ дар гипотеза, ки оғози синтези РНК дар як синфи вирусҳои РНК аз ҷиҳати функсионалӣ ва эволютсионӣ мувофиқат мекунад, пайваст кунем.
Полимеразаи аз РНК вобастаи РНК (RdRps)-и Nidovirales (Coronaviridae, Arterioviridae ва 12 оилаи дигар) ба домени амино-терминалӣ (N-терминал) дар протеини ғайрисохторӣ (nsp), ки аз полипротеин, ки NiRAN ном дорад, алоқаманд аст. 1ab аз протеазаи асосии вирусӣ (Mpro) иборат аст.Қаблан, вируси артериявии NiRAN-RdRp nsp дар бораи фаъолияти GMPylation/UMPylation гузориш дода шуда буд ва пешниҳод карда шуд, ки барои интиқоли монофосфати нуклеозид (NMP) ба вирус (ҳоло номаълум) ва/ё биополимеризатсияи ҳуҷайраҳо тавлид карда шавад.Дар ин ҷо мо нишон медиҳем, ки коронавирус (Коронавируси инсон [HCoV]-229E ва Синдроми шадиди роҳи нафас Coronavirus 2) nsp12 (NiRAN-RdRp) дорои фаъолияти NMPylation ба Mn2+ вобаста аст, ки аз nsp9 тавассути ташаккули nsp9 пас аз Mpro миёнаравӣ гирифта мешавад. nsps паҳлӯи N-терминали протеолитикӣ бароварда мешавад, фосфорамидат ба амини аввалия (N3825) дар N-терминали nsp9 пайваст мешавад.Дар ин реаксия нуклеотиди бартарӣ трифосфати уридин аст, аммо трифосфати аденозин, трифосфат гуанозин ва трифосфати ситидин ҳам субстратҳои мувофиқ мебошанд.Тадқиқоти мутатсия бо истифода аз сафедаҳои рекомбинати коронавируси nsp9 ва nsp12 ва мутантҳои аз ҷиҳати генетикӣ муҳандисии HCoV-229E пасмондаҳоеро муайян карданд, ки барои NMPylation тавассути NiRAN ва репликатсияи вирус дар фарҳанги ҳуҷайра заруранд.Маълумот пешгӯии пасмондаҳои сайти фаъоли NiRAN-ро тасдиқ кард ва нақши муҳими пасмондаҳои nsp9 N3826-ро дар nsp9 NMPylation ва репликатсияи вирус дар vitro муайян кард.Ин пасмонда як қисми пайдарпаии трипептидҳои N-терминали NNE мебошад ва ягона боқимондаи инварианти nsp9 ва гомологҳои он дар оилаи коронавирус мебошад.Таҳқиқоти мазкур барои омӯзиши функсионалии фаъолияти NMPylation-и дигар вирусҳои лонашуда заминаи мустаҳкам фароҳам меорад ва ҳадафҳои имконпазирро барои таҳияи доруҳои зидди вирусӣ пешниҳод мекунад.
Вируси РНК-и риштаи мусбати Nidovirales ба намудҳои гуногуни сутунмӯҳраҳо ва ҳайвоноти сутунмӯҳрана сироят мекунад (1, 2).Айни замон фармоиш 14 оиларо (3) дар бар мегирад, ки аз онҳо оилаи коронавирус дар 20 соли охир ба таври васеъ омӯхта шудааст.Дар он вақт, се коронавируси зоонотикӣ аз мизбони ҳайвонот пайдо шуда, боиси хуруҷи миқёси васеи сироятҳои шадиди роҳи нафас дар одамон шуданд.Аз ҷумла пандемияҳои доимӣ, ки дар натиҷаи бемориҳои шадиди сироятӣ ба вуҷуд меоянд.Синдроми роҳи нафас Коронавирус 2 (SARS-CoV-2) (4âââ7).Нидовирусҳо як созмони умумии геномро тақсим мекунанд ва зербахши комплекси репликатсия-транскрипсияи бо мембрана алоқаманд (RTC) дар 5-?²-терминали аз се ду ҳиссаи ва зербахши асосии сохтории заррачаи вирус, инчунин баъзе лавозимот рамзгузорӣ шудааст. .Протеин, ки дар 3??² дар сеяки охири геном рамзгузорӣ шудааст (1).Ба истиснои як оилаи вирусҳои планарӣ (Monoviridae) (8), ҳама вирусҳои лона гузошташуда зербахшҳои RTC-ро дар ду чаҳорчӯбаи калони хониш (ORF) ORF1a ва ORF1b, ки аз РНК геномии тарҷума шудаанд, рамзгузорӣ мекунанд.ORF1a полипротеин (pp) 1a-ро рамзгузорӣ мекунад ва ORF1a ва ORF1b якҷоя pp1ab-ро рамзгузорӣ мекунанд.Бо иштироки умумии протеазаи асосӣ (Mpro), ки аз ҷониби ORF1a рамзгузорӣ шудааст, ҳам pp1a ва ҳам pp1ab ба таври протеолитикӣ ба сафедаҳои гуногуни ғайрисохторӣ (nsps), ки бо номи 3CLpro низ маълуманд, коркард карда мешаванд, зеро он бо 3Cpro-и пикорнавирус гомология дорад ( 9).Чунин мешуморанд, ки ин nsps ба RTC-и бузурги динамикӣ ҷамъ шуда, синтези РНК-и геномӣ (репликатсия) ва маҷмӯи РНК-и субгеномӣ (транскрипсия) катализ мекунанд ва барои ҳамоҳангсозии ифодаи ORF, ки дар поёноби ORF1b ҷойгиранд (10? ?12).
RTC-и аслӣ аз РНК вобаста полимераза (RdRp) (13), супероилаи 1 геликаз (HEL1) (14, 15) ва якчанд ферментҳои коркарди РНК, ки асосан дар ORF1b ва дар оилаи коронавирус рамзгузорӣ карда мешаванд, дорои nsp12-nsp16 ва nsp9-nsp12 дар оилаи Arterioviridae (ниг. истинод ба 10ââ 12).RdRp ва HEL1 ду (панҷяки) доменҳои ҳифзшудаи вируси лонаи паррандаро намояндагӣ мекунанд ва дар байни дигар вирусҳои РНК гомология доранд.Гумон меравад, ки репликазаи аслӣ аз ҷониби зерқисматҳои дигар, аз ҷумла якчанд nsps хурд, ки аз минтақаи карбокси-терминали (C-терминали) pp1a, поёноби Mpro (коронавирус nsp5 ва вируси артериалӣ nsp4) бароварда мешаванд, кӯмак мекунанд.Онҳо дорои ҳифзи маҳдуди оилавӣ ва фаъолиятҳои гуногун мебошанд (дар истинод 10ââ12).
Нисбатан ба наздикӣ, домене бо хусусиятҳои мотиви пайдарпайии беназир дар терминали амин (N-терминус) дар наздикии RdRp дар ҳама вирусҳои лона пайдо шуд, аммо вирусҳои дигари РНК (16).Дар асоси ҷойгиршавӣ ва фаъолияти нуклеотид трансфераза (нуклеозидмонофосфат [NMP] трансфераза), ин домен NiRAN (transferase нуклеотидҳои марбут ба Nestvirus RdRp) номида мешавад.Комбинатсияи дугонаи домении NiRAN-RdRp дар оилаи Coronaviridae nsp12 ва nsp9 дар оилаи Arterioviridae-ро ташкил медиҳад ва дар дигар nestoviridae NiRAN-RdRp ҳамчун nsp мустақил аз полипротеини вирусӣ бароварда мешавад.Дар коронавирус домени NiRAN дорои ?1/450 пасмондаҳо мебошад ва ба домени C-терминали RdRp тавассути минтақаи пайвандкунанда пайваст мешавад (16?19).Дар Virus Arteritis Equine (EAV) (Arteriviridae), nsp9 рекомбинати Mn2+ фаъолиятҳои аз ион вобаста (худ) UMPylation ва GMPylation нишон медиҳад, ки аз се асоси пайдарпайии ҳифзшуда дар нестовирус, AN, BN ва CN Боқимондаҳои пайдарпай вобастаанд.Дар куҷо N маънои NiRAN аст) (16).Паҳлӯи N-терминали ин нақшҳо як мотиви камтар консервативии preAN мебошад.Баъзе аз ин пасмондаҳо инчунин дар киназаҳои протеинҳои дурдаст нигоҳ дошта мешаванд, ки дар он нишон дода шудааст, ки онҳо дар пайвастшавӣ ва фаъолияти каталитикии нуклеозид трифосфат (NTP) иштирок мекунанд (20, 21).Мувофиқи ин мушоҳида, якчанд боқимондаҳои асосии фаъоли сайт дар псевдокиназаи SelO аз Pseudomonas syringae метавонанд бо суперкомплекси ба наздикӣ нашршудаи SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 ҷамъ карда шаванд.Пасмондаҳои ҳифзшудаи Coronavirus NiRAN, ки дар микроструктураи электрон ҷойгир шудаанд.Протеини рекомбинантӣ (17).Тахмин меравад, ки U/GMPylation ҳуҷҷатшуда (худ) ҳолати муваққатиро барои интиқоли NMP ба субстрат (ҳоло номаълум) ба вуҷуд меорад (16) ва шабоҳати сохтории байни NiRAN ва протеин киназа (17, 19) ) Оё гипотеза ин аст, ки NiRAN сафедаҳои дигарро тағир медиҳад.
Бисёр хусусиятҳо, аз ҷумла робитаи систематикии беназир ва беназири он бо вирусҳои лона ва ҷудошавии генетикӣ аз RdRp, NiRAN-ро ба як ферментҳои асосноки танзимкунанда барои вирусҳои лона табдил медиҳанд, ки барои пайдоиш ва шахсияти онҳо муҳим аст.Пештар, се функсияи эҳтимолӣ бо NiRAN барои танзими геном / тарҷумаи субгеномӣ ё репликатсия / транскрипсия даъват карда шуданд.Ҳангоми баррасии маълумоти камёфт ва нопурра дар айни замон, ҳар як функсия афзалиятҳо ва нуқсонҳои худро дорад (16).Дар ин таҳқиқот, мо ҳадаф дорем, ки таҳқиқоти биохимиявӣ ва генетикии баръакси коронавирусҳоро, ки ду наслро намояндагӣ мекунанд, муттаҳид кунем ва бозёфтҳои худро дар заминаи эволютсионии мутатсияи табиии оилаи коронавирус ҷойгир кунем, то дар бораи ин олами пурасрор фаҳмем.Мо дар бораи дастовардҳои бузург дар фаҳмиши NiRAN тавассути муайян кардани ҳадафҳои табиӣ дар RTC гузориш медиҳем, ки (дар байни се фарзияи мавҷуда) ба нақши ин домен дар оғози синтези РНК-и вируси лона мусоидат мекунад.Ин тадқиқот инчунин имкониятҳоро барои нақшҳои дигари NiRAN дар интерфейси мизбони вирус мекушояд.
Барои тавсифи хосиятҳои ферментативии домени NiRAN вируси корона, nsp12, мо як шакли рекомбинантии коронавируси инсон 229E (HCoV-229E) nsp12-ро дар E. coli бо теги His6 дар терминали C истеҳсол кардем ва сафеда бо [α32-P ] Якҷоя бо NTP дар ҳузури MnCl2, тавре ки дар Маводҳо ва усулҳо тавсиф шудааст, инкубатсия кунед.Таҳлили маҳсулоти реаксия мавҷудияти протеини бо тамғаи радиоӣ муҳоҷиршавандаро бо nsp12 (106 кДа) нишон дод, ки нишон медиҳад, ки коронавирус nsp12 ташаккули протеини ковалентии NMP-ро катализ мекунад, ки афзалиятнок бо монофосфати уридин (UMP) ташкил карда мешаванд (Расми 1А) Ва В).Таҳлили миқдорӣ нишон дод, ки дар муқоиса бо дигар нуклеотидҳо, шиддатнокии сигнали пайвастани UMP 2 то 3 маротиба зиёд шудааст (расми 1С).Ин маълумот бо фаъолияти пешбинишудаи трансферазаи NMP домени NiRAN-и коронавирус мувофиқат мекунад (16), аммо нишон медиҳад, ки афзалиятҳои нуклеотидҳои домени NiRAN аз коронавирус ва вируси артериалӣ гуногунанд.
Фаъолияти худидоракунии NMPylation HCoV-229E nsp12.(A) HCoV-229E nsp12-His6 (106 кДа) бо NTP таъиншудаи [α-32P] дар ҳузури 6 mM MnCl2 барои 30 дақиқа инкубатсия карда шуд (барои тафсилот ба мавод ва усулҳо нигаред).Маҳсулоти реаксия аз ҷониби SDS-PAGE ҷудо карда шуда, бо кабуди дурахшон Coomassie ранг карда шуд.(B) Протеини радиоактивӣ бо тасвири фосфорӣ нишон дода мешавад.Мавқеъҳои nsp12-His6 ва маркерҳои массаи молекулавии сафедаҳо (бо килодалтонҳо) дар A ва B нишон дода шудаанд. (C) Шиддати сигнали радиоактивӣ (ба ҳисоби миёна ± SEM) аз се таҷрибаи мустақил муайян карда шуд.*P≤0,05.Қувваи сигнал (фоиз) ба UTP алоқаманд аст.
Гарчанде ки фаъолиятҳои ферментҳои марбут ба NiRAN барои такрори EAV ва SARS-CoV дар фарҳанги ҳуҷайра муҳиманд (16), функсияи мушаххаси NiRAN ва ҳадафҳои эҳтимолӣ ҳанӯз муайян карда нашудааст.Шабакаи сохтории ба наздикӣ гузоришшуда байни NiRAN ва як оилаи сафедаҳо бо қабатҳои ба сафедаи киназа монанд (17, 22) моро водор кард, ки фарзияро санҷем, ки NiRAN NMPylation сафедаҳои дигарро катализ мекунад.Мо як қатор ҳадафҳои эҳтимолии гомологиро тавлид кардем, аз ҷумла сафедаҳои ғайри сохторӣ, ки аз ҷониби HCoV-229E ORF1a рамзгузорӣ шудаанд (nsps 5, 7, 8, 9, 10), ки ҳар яки онҳо дорои теги C-терминали His6 (замимаи SI, Ҷадвали S1) мебошанд. ин сафедаҳо бо [α32-P] uridine triphosphate ([α32-P]UTP) дар ҳузур ё набудани nsp12 инкубатсия кунед.Альбумини хунобаи гов ва протеини синтези MBP-LacZα, ки дар E. coli тавлид шудааст, ҳамчун назорат хизмат мекарданд (Расми 2А, хатҳои 1 то 7).Протеини радиоактивй бо усули электрофорези натрий додецилсулфат-полиакриламид-гель (SDS-PAGE) ва авторадиография тахлил карда шуд ва маълум шуд, ки дар реак-цияи дорой nsp12 ва nsp9 сигнали пурзури радиоактивй мавчуд аст.Мавқеи сигнал ба массаи молекулавии nsp9 мувофиқат мекунад, ки бо nsp12 миёнаравии UMPylation аз nsp9 шаҳодат медиҳад (Расми 2B, суруд 7).Ягон сафедаҳои дигари санҷишӣ UMPylated нашудаанд, ки ин моро ба хулосае овард, ки nsp9 як субстрати мушаххаси nsp12 аст.Мувофиқи маълумоти худидоракунии NMPylation, ки дар расми 1 нишон дода шудааст, nsp12 қодир аст ҳамаи чор NMP-ро ба nsp9 интиқол диҳад, гарчанде ки самаранокӣ гуногун аст, UMP> монофосфати аденозин (AMP)> гуанозин монофосфат (GMP)> цитидин монофосфат (CMP) ) ( Сурат).3 А ва В).Дар шароити дар ин таҳлил истифодашуда (кӯтоҳ кардани реаксия ва вақти экспозиция, кам кардани консентратсияи nsp12; маводҳо ва усулҳо), худидоракунии NMPylation-и nsp12-ро ошкор кардан ғайриимкон аст (расми 2B, хати 7 ва расми 1Вро муқоиса кунед), ки исбот кард, ки самаранок (Ва якчанд давр) UMP аз nsp12 ба nsp9 кӯчид.Фаъолияти трансферазаи UMP мавҷудияти ионҳои Mn2+-ро талаб мекунад, тавре ки дар расми 3С нишон дода шудааст, дар ҳоле ки танҳо ҳадди ақали фаъолияти трансфераза UMP дар ҳузури Mg2+ мушоҳида шудааст ва дар ҳузури ду катионҳои дигари дувалентӣ санҷидашуда ҳеҷ гуна фаъолият нест.Маълумоти шабеҳ дар таҳлилҳои NMPylation, ки дорои трифосфати ситидин (CTP), гуанозинтрифосфат (GTP) ва аденозинтрифосфат (ATP) мебошанд (замимаи SI, Расми S1) ба даст оварда шуданд.
HCoV-229E nsp12 бо миёнаравии UMPylation аз nsp9.Як қатор субстратҳои сафеда (аз ҷумла альбумини хунобаи гов, MBP-lacZα ва як қатор nsps HCoV-229E бо C-терминали His6, ки аз ҷониби ORF1a рамзгузорӣ шудааст) барои арзёбии фаъолияти UMPylation-и HCoV-229E nsp12-His6⁺ миёнаравӣ истифода шуданд. протеин.Протеинро бо [α-32P] UTP барои 10 дақиқа дар сурати мавҷуд набудани (A) ё мавҷудияти (B) nsp12 тавре, ки дар мавод ва усулҳо тавсиф шудааст, инкубатсия кунед.Дар болои А ва В гели SDS-полиакриламиди бо Coomassie Brilliant Blue олудашуда ва дар поёни А ва В авторадиограммаҳои мувофиқ нишон дода шудаанд.Мавқеи аломати массаи молекулавии сафеда (бо килодалтонҳо) дар тарафи чап дода шудааст.Мавқеи nsp12-His6 (B, top) ва сигнали радиоактивӣ, ки ҳангоми инкубатсияи nsp12-His6 бо nsp9-His6 (B, хати 7) мушоҳида мешавад, нишон дода шудааст, ки [α-32P]UMP ба nsp9-His6 (12,9 кДа), ки барои дигар сафедаҳои санҷидашуда мушоҳида нашудааст.
Тавсифи биохимиявӣ ва вирусологии HCoV-229E NiRAN тавассути миёнаравии NMPylation nsp9.(А ва В) Нақши ко-субстрати нуклеотид, ки дар реаксия истифода мешавад.Nsp12-His6 ва nsp9-His6 дар ҳузури NTPҳои гуногун [α-32P] дар таҳлили стандартии NMPylation омехта ва инкубатсия карда мешаванд.(А, боло) nsp9-His6-и Coomassie оғушташуда бо SDS-PAGE ҷудо карда шудааст.(A, поён) Авторадиографи ҳамон минтақаи гел.(B) Фаъолияти нисбї (миёна ± SEM) дар њузури кофактори таъиншудаи нуклеотид аз се таљрибаи мустаќил муайян карда мешавад.*P≤0,05.$C) Наќши ионњои металлї.Санҷиши стандартии NMPylation дар ҳузури [α-32P] UTP ва ионҳои гуногуни металлӣ, ки ҳар кадоми онҳо консентратсияи 1 мМ нишон дода шудааст.Дар С, боло, Coomassie доғдор nsp9-His6 нишон дода шудааст ва дар C, поён, авторадиографияи мувофиқ нишон дода шудааст.Андозаи протеини нишондодашуда (бо килодалтонҳо) дар тарафи чапи A ва C нишон дода шудааст. (D) Шакли мутантии HCoV-229E nsp12-His6, ки ивазкунандаи аминокислотаҳои аминокислотаи муайяншударо дорад, дар [α-32P]UTP, тавре тавсиф шудааст, ҷойгир аст. дар Маводҳо ва усулҳо.nsp9-His6 бо тамғаи радиоӣ, ки дар реаксияи NMPylation тавлид шудааст, тавассути тасвири фосфоризатсия (D, боло) муайян карда мешавад.Фаъолияти нисбӣ дар муқоиса бо протеини навъи ваҳшӣ (wt) дар D нишон дода шудааст ва поёни он ҳамчун миёнаи (±SEM) аз се таҷрибаи мустақил гирифта мешавад.Ситорачаҳо ҷойгузинии пасмондаҳои ҳифзнашударо нишон медиҳанд.(E) Титри вирус дар супернатанти фарҳангии ҳуҷайраҳои p1, ки 24 соат пас аз сироят тавассути таҳлили лавҳа муайян карда шуд.Ҷойивазкунии кодонҳо дар домени NiRAN-и мутант таҳияшудаи HCoV-229E нишон дода шудаанд (рақамгузории боқимондаҳо ба мавқеи онҳо дар pp1ab асос ёфтааст).Мутанти nsp12_DD4823/4AA сайти фаъоли репликатсияи ноқиси RdRp ҳамчун назорат истифода шуд.
Барои дарки амиқтар дар бораи макони фаъоли NiRAN ва муайян кардани пасмондаҳои марбут ба фаъолияти трансферазаи NMP-и мушаххаси nsp9, мо таҳлили мутатсияро анҷом додем, ки дар он мо пасмондаҳои консервативиро дар мотивҳои NiRAN AN, BN ва CN иваз кардем ( 16) Ин Ала аст (замимаи SI, расми S2).Илова бар ин, таъсири ивазкунии консервативии Arg-to-Lys ё Lys-to-Arg дар ду ҳолат арзёбӣ карда шуд.Ҳамчун назорати (манфӣ), пасмондаҳое, ки дар домени NiRAN-и коронавирусҳо ва дигар вирусҳои лона нигоҳ дошта нашудаанд ё камтар нигоҳ дошта мешаванд, бо Ала иваз карда мешаванд. BN) ва D4280A (CN) nsp9 NMPylation тавассути nsp12-ро ба таври назаррас коҳиш медиҳад ё ҳатто нест мекунад, дар ҳоле ки сафедаҳо бо ивазкуниҳои консервативӣ (R4178K), K4116R) 60% ва 80% фаъолияти худро нигоҳ медоранд, ки ин нишон медиҳад, ки сабук шудани маҳдудиятҳо дар ҷониби онҳо. занҷирҳо аз ҷиҳати физикӣ-химиявӣ ҳассос мебошанд (Расми 3D).Иваз кардани якчанд пасмондаҳои дигари ҳифзшуда E4145A, D4273A, F4281A ва D4283A хеле камтар зараровар аст ва nsp9 UMPylation танҳо ба таври мӯътадил коҳиш меёбад.Натиҷаҳои шабеҳ дар реаксияҳои nsp9 NMPylation бо иштироки дигар NTPҳо (Расми 3D ва замимаи SI, Расми S3) ба даст оварда шуданд, ки тасдиқ мекунанд, ки таъсири мушоҳидашуда ба ивазкунии аминокислотаҳои аминокислотаҳо аз намуди ко-субстрати нуклеотиди истифодашаванда новобаста аст.Баъдан, мо таъсири эҳтимолии ин ивазкуниҳои nsp12-ро ба такрори коронавирусҳо дар фарҳанги ҳуҷайра санҷидем.Бо ин мақсад, мо қолабҳои мувофиқи генетикии муҳандисии ДНК (cDNA) -ро истифода бурдем, ки дар вируси рекомбинатии ваксина клононида шудаанд (23, 24) барои транскриптсияи 5-7 ҳуҷайра.Титр кардани насли вируси сироятӣ, ки дар ин ҳуҷайраҳо тавлид шудаанд, нишон дод, ки аксари мутантҳои HCoV-229E NiRAN қобили иҷро нестанд (Расми 3E).Гурӯҳи мутантҳои вирусии ғайри қобили ҳаёт алтернативаҳоеро дар бар мегиранд, ки барои нест кардан ё ба таври назаррас коҳиш додани фаъолияти трансферазаи NMP дар vitro нишон дода шудаанд (K4116A, K4135A, R4178A, D4188A, D4280A, D4283A), аммо ду алтернативаи дигар мавҷуданд (K4116R, E4105A) % захира карда шудааст?Фаъолияти NMPylation in vitro онҳо нишон медиҳад, ки маҳдудиятҳои иловагӣ ҷалб карда мешаванд.Ба ҳамин монанд, ду мутатсияи дигар (R4178K, F4281A), ки боиси коҳиши мӯътадили фаъолияти NMPylation-и NiRAN дар in vitro гардид, вирусҳои зинда тавлид карданд, аммо ин вирусҳо тавассути репликатсия титрҳоро ба таври назаррас коҳиш доданд.Мувофиқи маълумоти фаъолияти in vitro, ки дар расми 3D нишон дода шудааст, иваз кардани чор боқимондаи дигар, ки дар коронавирус ва/ё дигар вирусҳои лона нигоҳ дошта нашудаанд (K4113A, D4180A, D4197A, D4273A) (8, 16) насл бо вуҷуди доштани он вирусҳои қобили ҳаёт тавлид карданд. титри мӯътадил коҳишёфта нисбат ба вируси навъи ваҳшӣ (расми 3E).
Барои омӯхтани он, ки оё фаъолияти трансферазаи NMP бо миёнаравии NiRAN аз домени фаъоли RdRp вобаста аст, ду пасмондаҳои ҳифзшудаи Asp, ки дар ҳамоҳангсозии ионҳои металлии дувалентӣ (11) дар RdRp motif C иштирок мекунанд, бо Ала иваз карда шуданд. фаъолияти nsp9 NMPylation он, ки нишон медиҳад, ки фаъолияти nsp12 миёнаравӣ дар vitro nsp9 NMPylation фаъолияти полимеразро талаб намекунад (Замимаи SI, Расми S4).
Пас аз муқаррар кардани фаъолияти трансферазаи мушаххаси NMP9 барои nsp12, мо кӯшиш кардем, ки иловаи NMP-nsp9-ро тавассути масс-спектрометрия (MS) тавсиф кунем.Спектри пурраи массаи сафедаи рекомбинати HCoV-229E nsp9 қуллаи баландро дар 12,045 Да нишон дод (Расми 4А).Илова кардани nsp12 сифати nsp9-ро тағир надодааст, ки ин нишон медиҳад, ки nsp12 ва nsp9 дар шароити истифодашуда (денатуратсия) комплекси устуворро ташкил намекунанд (расми 4А).Дар ҳузури UTP ва GTP, андозагирии массаи реаксияи дорои nsp9 ва nsp12 нишон дод, ки массаи сафедаи UTP 306 Да ҳаракат кардааст ва массаи сафедаи GTP 345 Да ҳаракат кардааст, ки нишон медиҳад, ки ҳар як молекулаи nsp9 як UMP ё GMP-ро мепайвандад. (Расми 4) C ва D).Тахмин меравад, ки энергияи зарурӣ барои NMPylation тавассути NiRAN миёнаравӣ nsp9 аз гидролизи NTP ва баровардани пирофосфат ба даст меояд.Гарчанде ки дар ин реаксия 10-каратаи молярии nsp9 (ҳадаф) нисбат ба nsp12 (фермент) истифода шудааст, тақрибан пурраи NMPylation nsp9 мушоҳида карда шуд, ки ин нишон медиҳад, ки таъсири мутақобилаи nsp12 ва nsp9 кӯтоҳмуддат аст ва nsp12 метавонад NMP9 бештар NMPylate кунад. молекулаи in vitro.
NMPylation ягонаи nsp9 дар ҳузури nsp12 ва UTP ё GTP.Спектри массаи сафедаи мукаммали HCoV-229E nsp9 (замимаи SI, Ҷадвали S1) (AD) нишон дода шудааст.(A) nsp9 танҳо, (B) nsp9 + nsp12-His6, (C) nsp9 + nsp12-His6 дар ҳузури UTP, (D) nsp9 + nsp12-His6 дар ҳузури GTP.
Барои муайян кардани боқимондаҳои nsp9 UMPylated аз ҷониби nsp12, nsp9-UMP бо трипсин ҷудо карда шуд.Пептидҳои ҳосилшуда тавассути хроматографияи моеъи нано-баланд (HPLC) ҷудо карда шуданд ва тавассути тандем-спектрометрия (MS/MS) онлайн таҳлил карда шуданд.Таҳлили маълумот бо истифода аз бастаи нармафзори Byonic (Protein Metrics) UMPylation-и аминокислотаи N-терминалиро нишон дод.Ин ба таври дастӣ тасдиқ карда мешавад.Спектри массаи тандемии пептиди прекурсори [UMP]NNEIMPGK (замимаи SI, расми S5A) порчаеро дар 421 м/з ошкор кард, ки нишон медиҳад, ки UMP ба боқимондаи 1-и nsp9 мепайвандад.
Дар N-терминуси nsp9, Asn дар байни аъзоёни Orthocoronavirinae нигоҳ дошта мешавад (замимаи SI, Расми S6).Гарчанде ки мо боварӣ дорем, ки нитрогени ибтидоии амин N-терминал қабулкунандаи эҳтимолии UMP аст, мо тасмим гирифтем, ки далелҳои иловагии ҳатмии NMP-ро дар N-терминал ба даст орем.Аз ин сабаб, пептид N-терминали NMPyted ва NMPylated nsp9, ки бо HPLC тоза карда шудааст, дар ҳузури ацетон ва цианоборогидриди натрий ба даст оварда шудааст.Дар ин шароит танҳо аминҳои озоди ибтидоиро бо пропил (25) тағир додан мумкин аст.Пептиди N-терминали nsp9 бо пайдарпаии NNEIMPGK дорои ду амини ибтидоӣ мебошад, ки яке дар N-терминали Асн ва дигаре дар занҷири паҳлӯи Lys дар C-терминус аст.Аз ин рӯ, гурӯҳҳои пропилро дар ҳарду ҷониб ворид кардан мумкин аст.Хроматограммаҳои ионҳои истихроҷшудаи пептидҳои ғайри NMPилшуда дар замимаи SI, расми S5B нишон дода шудаанд.Тавре ки интизор мерафт, N-терминал ва C-терминали (моно)пропилонидашуда (замимаи SI, Расми S5B, хати боло) ва пептидҳои дипропилатӣ (замимаи SI, Расми S5B, хати поён) метавонанд муайян карда шаванд.Ин намуна бо истифодаи пептиди NMPylated N-терминали nsp9 тағир меёбад.Дар ин ҳолат, танҳо пептидҳои пропилшудаи C-терминалро муайян кардан мумкин аст, аммо пептидҳои пропилшудаи N-терминалӣ ва пептидҳои дипропилатӣ муайян карда нашудаанд (Замимаи SI, Расми S5C), ки нишон медиҳад, ки UMP ба амини ибтидоии N-терминалӣ интиқол дода шудааст. гурӯҳ аз ворид кардани тағйирот.
Минбаъд, мо пасмондаҳои ҳифзшударо дар N-терминуси nsp9 иваз мекунем (бо Ala ё Ser) барои муайян кардани маҳдудиятҳои мушаххаси ҳадаф.Дар асоси маълумоти MS мо, ки нишон медиҳад, ки NiRAN як иловаи nsp9-NMP-ро бо амини ибтидоии боқимондаи N-терминали nsp9 ташкил медиҳад, мо фарзия кардем, ки NMPylation nsp9 протеазаи устои вирусиро (Mpro, nsp5) талаб мекунад, то nsp9 N-терминалиро аз пешгузаштаи полипротеини он.Барои санҷидани ин фарзия, мо як протеини пешгузаштаи nsp7-11-ро, ки дорои nsp9 дар E. coli дорад, истеҳсол кардем ва санҷиши стандартии NMPylation дар ҳузури [α-32P] UTP (маводҳо ва усулҳо) анҷом додем.Тавре ки дар расми 5А нишон дода шудааст (хати 3), прекурсори буриданашуда nsp7-11 бо nsp12 тамғаи радиоӣ надорад.Баръакси ин, агар nsp7-11 аз ҷониби nsp5 рекомбинантӣ ҷудо карда шавад, то nsp9 (ва дигар nsps) аз прекурсор озод карда шавад, як сафедаи аломати радиоӣ, ки бо nsp9 муҳоҷират мекунад, ошкор карда мешавад, ки хулосаи моро тасдиқ мекунад, ки NiRAN ва N- Ташаккули интихобии иловаҳои ковалентии nsp9-NMP .Амини ибтидоии терминали N-терминали Asn (мавқеи 3825 дар pp1a/pp1ab).Ин хулоса инчунин бо таҷрибаҳо бо истифода аз сохтори nsp9, ки як ё ду боқимондаи иловагӣ дар терминали N дорад, тасдиқ карда мешавад.Дар ҳарду ҳолат, UMPylation бо миёнаравии NiRAN аз nsp9 бекор карда шуд (Замимаи SI, Расми S7).Сипас, мо сафедаеро бо як ё ду пасмондаҳои Asn истеҳсол кардем, ки аз пайдарпаии пептидҳои 3825-NNEIMPK-3832 дар N-терминали nsp9 тоза карда шудаанд.Дар ҳарду ҳолат, nsp9 UMPylation комилан баста шуд (Расми 5B), далели иловагиро фароҳам меорад, ки воқеии nsp9 N-терминус ҳамчун ресептори NMP амал мекунад.
Коркарди протеолитикии nsp9 ва нақши пасмондаҳои N-терминалӣ дар UMPylation бо миёнаравии nsp12.(A) nsp9 UMPylation як терминали ройгони nsp9 N-ро талаб мекунад.Nsp7-11-His6 дар 30 °C дар буфери муайянкунии NMPylation дорои UTP дар ҳузур ё набудани Mpro рекомбинантӣ (nsp5-His6) пешакӣ инкубатсия карда мешавад.Пас аз 3 соат, таҳлили NMPylation бо илова кардани nsp12-His6 тавре, ки дар Маводҳо ва усулҳо тавсиф шудааст, оғоз кунед.Реаксияи дорои nsp5-His6 (хати 1) ва nsp9-His6 (хати 2) ҳамчун назорат истифода шуд.Пас аз 10 дақиқа, реаксия қатъ карда шуд ва омехтаи реаксия тавассути SDS-PAGE ҷудо карда шуд.Протеин бо Coomassie Brilliant Blue (A, боло) ранг карда шуд.Дар тарафи рост прекурсори Nsp7-11-His6 ва маҳсулоти коркардшуда дар натиҷаи тақсимоти миёнаравӣ nsp5-His6 нишон дода шудааст.Лутфан таваҷҷӯҳ намоед (аз сабаби андозаи хурди онҳо) nsp7 ва nsp11-His6 дар ин гел муайян карда намешаванд ва реаксия бо nsp5-His6 (қаторҳои 1 ва 4; мавқеъи nsp5-His6 бо доираи сахт нишон дода шудааст) ё nsp9-His6 (Lane 2) дорои миқдори ками MBP (бо доираҳои кушода нишон дода шудааст) ҳамчун наҷосати боқимонда, зеро онҳо ҳамчун сафедаҳои меёфтшавии MBP ифода карда мешаванд (замимаи SI, Ҷадвали S1).(B) Варианти Nsp9-His6 як ё ду боқимондаи N-терминали Asn надорад (рақамгузории боқимонда мувофиқи мавқеъ дар pp1a/pp1ab) ва бо nsp12-His6 ва [α-32P] UTP пок ва инкубатсия карда мешавад.B, SDS-PAGE, ки бо Coomassie ранг карда шудааст, дар боло нишон дода шудааст, B, авторадиографи мувофиқ дар поён нишон дода шудааст.Мавқеи аломати вазни молекулавӣ (бо килодалтонҳо) дар тарафи чап нишон дода шудааст.(C) Пасмондаҳои HCoV-229E nsp9-His6 N-терминали ҳифзшуда бо Ала ё Ser иваз карда шуданд ва ҳамон миқдор сафеда дар реаксияи UMPylation миёнаравии nsp12-His6 истифода шуд.Маҳсулоти реаксия тавассути SDS-PAGE ҷудо карда шуда, бо Coomassie Brilliant Blue (C, боло) ранг карда шуд ва nsp9-His6 бо аломати радиоӣ бо тасвири фосфорессенсия (C, миёна) муайян карда шуд.Бо истифода аз протеини навъи ваҳшӣ (ваз) ҳамчун истинод (ба 100%), фаъолияти нисбии NMPylation (ба ҳисоби миёна ± SEM) аз се таҷрибаи мустақил ҳисоб карда шуд.(D) Титрҳои вирус дар супернатанти фарҳанги ҳуҷайраи p1 ҳуҷайраҳои Huh-7, ки бо ҳуҷайраҳои навъи ваҳшӣ HCoV-229E сироят шудаанд ва мутантҳое, ки ивазкунандаи аминокислотаҳои аминокислотаҳои таъиншударо дар nsp9 бо таҳлили лавҳа муайян карданд.Мутанти дукаратаи RdRp C, ки аз репликатсия кам аст, ҳамчун назорати манфӣ истифода шудааст.
N-терминуси nsp9 (махсусан мавқеъҳои 1, 2, 3 ва 6) дар байни аъзоёни зероилаҳои Orthocoronavirinae хеле ҳифз шудаанд (замимаи SI, Расми S6).Барои омӯхтани нақши эҳтимолии ин пасмондаҳо дар NMPylation nsp12 миёнаравӣ, ду пасмондаҳои пайдарпайи Asn дар N-терминуси nsp9 бо Ала ё Ser (танҳо ё дар якҷоягӣ) иваз карда шуданд.Дар муқоиса бо навъи ваҳшӣ nsp9, иваз кардани N3825 бо Ala ё Ser боиси беш аз ду маротиба коҳиш ёфтани UMPylation бо миёнаравии nsp12 гардид (Расми 5C).Мувофиқи хулосаи мо, ки NMPylation дар амини ибтидоии N-терминалӣ ба ҷои занҷири паҳлӯии боқимондаи N-терминалӣ рух медиҳад, мо NMPylation-и назарраси боқимондаро бо иваз кардани N3825A ва N3825S мушоҳида кардем.Ҷолиб он аст, ки агар Asn дуюм бо Ала ё Сер иваз карда шавад, nsp9 UMPylation сахттар коҳиш меёбад (зиёда аз 10 маротиба), дар ҳоле ки иваз кардани Ала дар мавқеъҳои 3, 4 ва 6 танҳо ба nsp9 UMPylation таъсири мӯътадил дорад (Расми 2). ).5C).Натиҷаҳои шабеҳ бо истифода аз ATP, CTP ё GTP ба даст оварда шуданд (замимаи SI, Расми S8).Дар маҷмӯъ, ин маълумотҳо нақши калидии N2826 (мавқеи 2 дар nsp9) дар nsp9 NMPylation нишон медиҳанд.
Барои ба даст овардани далелҳои иловагии таносуби функсионалии байни N-терминуси nsp9 ва NMPylation, мо як ҳамоҳангсозии пайдарпайии сершумор (MSA) -и пайдарпаии nsp9-и оилаи Коронавирусро анҷом додем (аз 104 то 113 боқимонда фарқ мекунад) (Замимаи SI, расми). S6).Дар маҷмӯъ, дар 47 намуди (маълум ва тахминӣ) аз 5 насли зерфамилияи Orthocoronavirinae, ки ба ҳайвоноти ширхӯр, паррандагон ва мизбонҳои хазанда сироят мекунанд, ҳамагӣ 8 боқимонда дар маҷмӯъ инвариант буданд.Тағйироти васеътарин, аз ҷумла ҳазф ва дохилкунӣ, дар давраҳои байни унсурҳои сохтори дуюмдараҷаи nsp9, ки аз ҷониби таҳқиқоти сохтории қаблӣ муайян карда шудааст, мушоҳида карда шуданд (26 ??28).Дар риштаи β ва α спирали қисми C-терминали nsp9 панҷ боқимондаи инвариантӣ пайдо шуданд.Се боқимондаи инварианти мотиви NNE-и N терминали nsp9-ро ташкил медиҳанд.Муайян карда мешавад, ки Asn дуюми ин мотив ягона боқимондаи инвариантиест, ки онро nsp9-и гипотетикии коронавируси қурбоққа ба дур алоқаманд муштарак дорад ва намуди Microhyla letovirus 1-ро дар зерсохтори Letovirinae аз Alphaletovirus ифода мекунад.Нигоҳдории пасмондаҳоро дар унсурҳои сохтори дуюмдараҷаи nsp9 метавон тавассути мулоҳизаҳои сохторӣ барои нигоҳ доштани хосиятҳои қатшаванда ё маълуми РНК ба эътидол овардан мумкин аст.Аммо, ба назар чунин мерасад, ки ин далел ба нигоҳдории NNE дахл надорад ва пеш аз ин таҳқиқот, табиати маҳдудиятҳое, ки тағирёбии пайдарпаии трипептидҳоро маҳдуд мекунанд, комилан пӯшида буд.
Бо мақсади муайян кардани аҳамияти nsp9-NMPylation ва нигоҳдории NNE дар репликатсияи коронавирус, мо мутантҳои HCoV-229E истеҳсол кардем, ки ивазкунии як ё дукаратаи пасмондаҳои N-терминали nsp9 доранд, ки ин нишон медиҳад, ки nsp9 NMPylation in vitro зараровар аст.Пеш аз оғози кор, мо кӯшиш мекунем, ки ба савол ҷавоб диҳем, ки оё ин ивазкунӣ (дар наздикии макони тақсимшавӣ nsp8 | 9) ба коркарди протеолитикии минтақаи C-терминали pp1a таъсир мерасонанд.Маҷмӯи сохторҳои полипротеини nsp7-11, ки дорои ивазкуниҳои мувофиқ дар N-терминуси nsp9 дар E. coli истеҳсол карда шуданд ва бо рекомбинант Mpro бурида шуданд.Ҷудошавии протеолитикии чор макон (аз ҷумла макони паҳлӯи nsp9) ба ҳеҷ гуна ивазкуниҳои воридшуда ба таври назаррас таъсир намерасонад (замимаи SI, Расми S9), ба истиснои тағироти сохтории ин сафедаҳо, ки ба тақсимоти Mpro-миёнадори nsp8 | 9 халал мерасонанд (ё дигар) вебсайт.
Ҳуҷайраҳои Huh-7 бо RNA-и дарозии HCoV-229E трансфексия карда шуданд, ки ивазкунии Ала ё Серро дар трипептидҳои ҳифзшудаи NNE (N3825, N3826 ва E3827) дар терминали nsp9 N рамзгузорӣ мекунанд ва нишон медиҳанд, ки аксари мутатсияҳо марговаранд.Мо тавонистем вирусро тавассути иваз кардани Ser ё Ala-и N-терминали Asn (N2835A ё N2835S) наҷот диҳем, аммо натавонистем вирусро бо дигар мутатсияҳои ягона ва дугона дар пайдарпаии NNE (N3826A, N3826S, NN3825/6AA, NN3825/6SS), E3827A) (Расми 5D).
Ин натиҷаҳо нишон медиҳанд, ки такрори коронавирусҳо дар фарҳанги бофтаҳо маҳдуд аст (якхела ё шабеҳ), мутатсияи табиии маконҳои NMPylation дар баданро маҳдуд мекунад ва нақши калидии ин вокунишро дар давраи зиндагии коронавирусҳо дастгирӣ мекунад.
Дар маҷмӯи охирини таҷрибаҳо мо C-терминали His6-ро бо нишони SARS-CoV-2 nsp12 ва nsp9 ва ду шакли мутантии nsp12 дар E. coli истеҳсол кардем.Пасмондаҳои фаъоли сайт дар доменҳои NiRAN ва RdRp мутаносибан ба ҷои Ala истифода шуданд (Расми 6А ва замимаи SI, Ҷадвали S2).K4465 дар SARS-CoV-2 nsp12 ба K4135 дар HCoV-229E мувофиқат мекунад (Замимаи SI, Расми S2), ки барои фаъолияти NiRAN ва такрори HCoV-229E зарур аст (Тасвири 3D ва E).Ин пасмонда инчунин ба боқимондаи вируси артериалӣ EAV nsp9 K94 мувофиқат мекунад, ки қаблан нишон дода шуда буд, ки барои NiRAN-UPylation/self-GMPylation зарур аст (16).Тавре ки дар расми 6B нишон дода шудааст, SARS-CoV-2 nsp12 дорои фаъолияти UMP трансфераза бо истифода аз nsp9 ҳамчун субстрат, дар ҳоле ки мутант сайти фаъоли nsp12_K4465A ғайрифаъол аст.Ивазкунии дукарата дар пайдарпаии хоси SDD-и мотиви RdRp C ба фаъолияти трансферазаи UMP таъсир намерасонад (Расми 6В), ин нишон медиҳад, ки фаъолияти RdRp ба nsp9 UMPylation таъсири мустақим надорад.Маълумоти шабеҳ бо истифода аз CTP, GTP ва ATP гирифта шудааст (замимаи SI, Расми S10).Хулоса, ин маълумотҳо нишон медиҳанд, ки NMPylation тавассути NiRAN миёнаравӣ nsp9 дар коронавирусҳо, ки наслҳои гуногуни зероилаҳои ортокоронавирусро намояндагӣ мекунанд, фаъолияти консервативӣ дорад.
SARS-CoV-2 nsp12 бо миёнаравии NMPylation аз nsp9.(A) Coomassie бо гели SDS-полиакриламидӣ ранг карда шудааст, ки сафедаи рекомбинантиро, ки дар санҷиши NMPylation истифода мешавад, нишон медиҳад.Ҳамчун назорат, як протеини мутант бо ивазкунии фаъоли сайт дар домени NiRAN (K4465A) ва домени RdRp (DD5152/3AA) аз SARS-CoV-2 nsp12 истифода шуд.Рақамгузории боқимонда аз рӯи мавқеъ дар pp1ab асос ёфтааст.(B) Авторадиографи муайянкунии UMPylation бо истифода аз nsp9-His6 ва [α-32P]UTP ҳамчун субстрати nsp12-His6 (навъи ваҳшӣ [wt] ва мутант).Массаи молекулавии (бо килодалтонҳо) сафедаи нишонашуда дар тарафи чап нишон дода шудааст.
Доменҳои NiRAN одатан дар Nidovirales (16) нигоҳ дошта мешаванд, ки ин нишон медиҳад, ки онҳо реаксияҳои ферментативиро, ки барои такрори Нидовирус заруранд, катализ мекунанд.Дар ин таҳқиқот, мо тавонистем исбот кунем, ки домени NiRAN-и коронавирус NMP-ро (аз NTP тавлидшуда) ба nsp9, протеини пурасрор РНК-ро, ки дар репликатсияи вирусҳо иштирок мекунад (26 ?? 29) интиқол медиҳад, то онро ҳамчун ҳадафи табиӣ муайян кунад ва шарики коронавирус RTC.
Домени NiRAN се мотиви пайдарпайро (AN, BN ва CN) тақсим мекунад, ки шумораи хеле ками пасмондаҳоро дар бар мегирад, ки дар ҳама оилаҳо дар тартиби монофилетикӣ, вале хеле фарқкунандаи Nidovirales нигоҳ дошта мешаванд (8, 16).Тадқиқотҳои охирин нишон доданд, ки онҳо аз ҷиҳати сохторӣ бо як оилаи бесифати сафедаҳои киназа монанданд, ки дар ибтидо оилаи SelO номида мешуданд (17, 19, 22, 30, 31).Протеинҳои марбут ба SelO дорои қабатҳои киназа мебошанд, аммо дар киназаҳои классикӣ якчанд пасмондаҳои фаъоли ҳифзшуда надоранд (22, 32).Дар асоси самти баръакси молекулаҳои ATP, ки ба макони фаъол пайвастанд ва бо таъсири мутақобилаи мушаххас устувор карда шудаанд, SeO гипотеза карда шуд ва баъдан тасдиқ карда шуд, ки AMP (ба ҷои фосфат) ба субстрати сафеда (22) интиқол дода мешавад, дар ҳоле ки сафедаи дигари бактериявии ба SelO монанд YdiU дорад. ба наздикӣ нишон дода шудааст, ки пайвастагии ковалентии UMP ба Тир ва боқимондаҳои ӯ аз субстратҳои сафедаи гуногун катализ мекунад (33).
Барои тасдиқ ва тавсеаи пешгӯии боқимондаҳои эҳтимолии макони фаъоли домени коронавируси NiRAN, мо усулҳои генетикии биохимиявӣ ва баръаксро барои анҷом додани таҳлили мутатсия дар коронавирус nsp12 истифода кардем (Расми 3D ва E ва SI замима, расми S3 ва ҷадвал) S1â S4).Маълумот нишон медиҳад, ки иваз кардани HCoV-229E K4135, R4178 ва D4280 бо Ала фаъолнокии трансферазаи NMP ва такрори вирусро дар фарҳанги ҳуҷайра (расми 3D ва E ва SI, расми S3) нест мекунад ва мавҷудияти онҳоро дар NTP γ-фосфат дастгирӣ мекунад. (K4135, R4178) ва ҳамоҳангсозии ионҳои металлии фаъол (D4280).Ивазкунии E4145A-и Glu-и консервшуда дар доираи вируси лонаи парранда, ки барои мӯътадил кардани мавқеи K4135 (17) пешбинӣ шудааст, барои нест кардани такрори вирус нишон дода шудааст, аммо тааҷҷубовар аст, ки фаъолият дар таҳлили NMPylation in vitro нигоҳ дошта шуд (Тасвири 3D ва E ва Замимаи SI, Расми S3 ва Ҷадвалҳои S1–S4).Мушоҳидаи шабеҳ ҳангоми ворид кардани ивазкунии мувофиқ дар гомологи YdiU аз Salmonella typhimurium (E130A) (33) анҷом дода шуд.Якҷоя гирифта шуда, ин маълумотҳо на вазифаи каталитикӣ вазифаи танзимкунандаи ин пасмондаро дастгирӣ мекунанд.
Иваз кардани пасмондаи ҳифзшудаи Phe (F4281A) дар доираи нестовирус дар домени HCoV-229E NiRAN (8) боиси кам шудани фаъолияти NMPylation in vitro ва коҳиши назарраси такрори вирус дар фарҳанги ҳуҷайра гардид (Расми 3D, E ва SI) замима, Расми S3).Маълумот бо функсияи муҳими танзимкунандаи ин пасмонда, ба монанди боқимондаи гомологии DFG Phe, ки қаблан нишон дода шудааст, мувофиқ аст.Дар киназаҳои сафедаи классикӣ, он як қисми ҳалқаи Mg2 + аст ва барои ҷамъоварӣ ва танзими сутунмӯҳра кӯмак мекунад???Барои фаъолияти самараноки каталитикӣ зарур аст (32, 34).Иваз кардани Ала ва Арг барои боқимондаҳои K4116 (дар motif preAN), мутаносибан репликатсияи вирусиро нест кард ва тавре интизор мерафт, вобаста ба занҷири паҳлӯи аминокислотаҳои воридшуда ба фаъолияти NMP трансфераза дар vitro таъсири гуногун дошт (Замимаҳои расми 3D ва E ва SI). , Расми S3).Маълумоти функсионалӣ бо маълумоти сохторӣ мувофиқат мекунад, ки нишон медиҳад, ки ин пасмонда бо фосфати ATP таъсири мутақобила муқаррар кардааст (17).Дар домени NiRAN-и дигар оилаҳои вирусҳои лона ҷойгиршуда, мавқеи HCoV-229E pp1a/pp1ab K4116 аз ҷониби Lys, Arg ё His (8) ишғол карда мешавад, ки ин нишон медиҳад, ки маҳдудияти функсионалии ин пасмондаҳои мушаххас сабук шудааст.Ивазкунии D4188A ва D4283A фаъолияти ферментро аз байн мебарад ё ба таври қатъӣ коҳиш медиҳад ва такрори вирусро нест мекунад (Расми 3).Ин ду боқимонда дар аксари (вале на ҳама) вирусҳои лона гузошташуда (8) нигоҳ дошта мешаванд, ки ин функсияи муҳими хоси оилавӣ, вале эҳтимолан ғайри каталитикиро нишон медиҳад.Ба сифати назорат ивазкунии Ала аз якчанд пасмондаҳои дигари Lys ва Asp (K4113A, D4180A, D4197A ва D4273A), ки дар Coronaviridae ё дигар оилаҳои Nestioviridae (8) нигоҳ дошта намешаванд, истифода шуданд.Тавре ки интизор мерафт, ин ивазкуниҳо асосан таҳаммулпазиранд ва дар баъзе мавридҳо каме кам шудани фаъолияти ферментҳо ва такрори вирусҳо (Расми 3 ва замимаи SI, Расми S3).Дар маҷмӯъ, маълумоти мутагенези коронавирус бо маълумоти генетикии худ GMP ва баръакси EAV NiRAN-RdRp (16), ки дар он EAV nsp9 (коронавирус nsp12 ortholog) боқимондаи K94 (мувофиқ ба HCoV- 229E K4135) вазифаҳои муҳим дорад), хеле мувофиқ аст. R124 (мувофиқ ба R4178), D132 (мувофиқ ба D4188), D165 (мувофиқ ба D4280), F166 (мувофиқ ба F4281).Илова бар ин, маълумот оид ба мутагенези HCoV-229E бо маълумоти генетикии баръакси SARS-CoV (16), ки қаблан гузориш дода шуда буд, мувофиқ ва васеъ карда шудааст, ҳамон тавре ки ба маълумотҳое, ки барои мотиви мувофиқи CN мушоҳида шудааст, муттанти SARS-CoV_nsp12 Phe-to-Ala мушоҳида шудааст. фенотипи тавсифшуда -F219A ва HCoV-229E_F4281A (Расми 3 D ва E ва SI замима, Расми S3 ва Ҷадвали S1-S4).
Дар муқоиса бо ортологҳои EAV (16), ки бартарии равшани UTP ва GTP доранд (дар аксуламали худидоракунии NMPylation), омӯзиши мо нишон медиҳад, ки домени коронавируси NiRAN (бо HCoV-229E ва SARS-CoV-2 муаррифӣ мешавад) метавонад самаранок бошад. интиқол дода шуд Ҳамаи чор NMPs, гарчанде ки бартарии каме ба UMP вуҷуд дорад (Расмҳои 1 ва 3).Хусусияти нисбатан пасти ко-субстрати мушаххаси NTP бо сохтори суперкомпозитии ба наздикӣ гузоришшуда SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 мувофиқ аст, ки дар он ADP-Mg2+ ба макони фаъоли NiRAN мепайвандад, аммо на бо қисми аденин ташаккули муносибатҳои мушаххас (17).Дар таҳқиқоти мо, навъи нуклеотид, ки дар реаксияи NMPylation истифода мешавад, ба фаъолияти протеини мутант таъсири дифференсиалӣ надорад (Замимаи SI, Расми S3), ки ин нишон медиҳад, ки ҳеҷ яке аз ин пасмондаҳо бо пайвасти нуклеобазаи мушаххас зич алоқаманд нестанд.Асоси сохторӣ ва аҳамияти потенсиали биологии афзалиятҳои муштараки NTP, ки дар доменҳои NiRAN аз коронавирусҳо ва вирусҳои артериалӣ мушоҳида мешаванд, бояд омӯхта шаванд;онҳо метавонанд ҳақиқӣ бошанд ё бо сабаби маҳдудиятҳои омӯзиши мувофиқи онҳо бошанд.Дар айни замон истисно кардан мумкин нест, ки фаъолияти потенсиалии NMPylator-и вируси артериявии домени NiRAN (нисбат ба фаъолияти худи NMPylation, ки қаблан тавсиф шудааст) афзалияти дигари ко-субстрат дорад, бо назардошти он, ки шабоҳати байни артерия ва коронавирус Домени NiRAN дар ҳадди худ қарор дорад.Муқоисаи пайдарпай (16).Дар муқоиса бо псевдокиназа SelO, ки Mg2+-ро ҳамчун кофактор истифода мебарад, фаъолияти коронавирус ва вируси артериалӣ NiRAN аз Mn2+ вобаста аст (16) (Расми 3С ва замимаи SI, Расми S1).Вобастагии Mn2+ ва афзалияти ошкор ба UTP хусусияти ғайриоддии сафедаи NMPylators мебошад ва танҳо ба наздикӣ дар протеини YdiU аз Salmonella typhimurium тасдиқ карда шудааст, ки катализкунии чаперонеи сафедаи ба Mn2+-ро UMPylation барои муҳофизат кардани ҳуҷайраҳо аз ҳавзи стресси ҳуҷайраҳои ATP катализ мекунад. 33).
Монандии сохтории ба наздикӣ тавсифшуда байни домени коронавируси NiRAN ва киназаҳои сафедаи ҳуҷайра (17, 19) барои қобилияти NiRAN барои пайваст кардани NMP бо сафедаҳои дигар, ки мо дар ин таҳқиқот гузориш додаем, дастгирии иловагӣ медиҳад.Мо ҷустуҷӯи ҳадафҳои эҳтимолии NiRAN-ро ба сафедаҳое равона кардем, ки аз ҷониби HCoV-229E ORF1a рамзгузорӣ шудаанд, ки маълуманд, ки мустақиман ё бавосита ба репликазаи RTC-ро бо рамзгузоришудаи ORF1b кумак мекунанд (12, 35).Таҷрибаҳои мо барои самаранок ва мушаххаси NMPylation nsp9 далелҳои қатъӣ пешниҳод мекунанд (Расми 2).Агар протеини мақсаднок дар миқдори зиёдатии молярӣ истифода шавад, ки аз 8 то 10 маротиба аз фермент (nsp12) зиёдтар аст, он тасдиқ карда мешавад, ки nsp9 пурра (моно) NMP шудааст (расми 4).Мо ба хулосае омадем, ки таъсири мутақобилаи nsp12 ва nsp9 кӯтоҳмуддат аст ва комплекси устуворро бо nsp9 ташкил намекунад (дар сурати мавҷуд набудани зербахшҳои дигари RTC).Ин хулоса аз ҷониби таҳқиқоти мутақобилаи сафедаҳо дар протеоми SARS-CoV тасдиқ карда мешавад (35).Таҳлили MS аминоки ибтидоии пасмондаи N-терминали nsp9-ро ҳамчун макони NMPylation муайян кард (замимаи SI, Расми S5).Ташаккули пайванди фосфорамидат ва гурӯҳи аминокислотаҳои N-терминалӣ фаъолияти NMPylation бо миёнаравии NiRAN аз реаксияи AMPylation Pseudomonas syringae, ки ташаккули AMP бо O-пайвандро дар боқимондаҳои Ser, Thr ё Tyr катализ мекунад, фарқ мекунад. 22) ва S. typhimurium YdiU изофаҳои O-пайванд (бо Тир) ва N-пайвандро (бо Ӯ) пептид-UMP-ро ташкил медиҳанд.Маълумоти маҳдуде, ки дар бораи оилаи сафедаҳои SelO мавҷуд аст, нишон медиҳад, ки аъзоёни ин оилаи калони сафеда дар ташаккули иловаҳои пептид-NMP фарқ мекунанд.Ин як мушоҳидаи ҷолиб аст, ки сазовори омӯзиши минбаъда аст.
Маълумоте, ки дар ин таҳқиқот ба даст оварда шудааст, моро водор сохт, ки фарзия кунем, ки NMPylation аз nsp9 як терминали ройгони N-ро талаб мекунад.Дар заминаи репликатсияи вирусӣ, ин тавассути тақсимоти протеолитикии макони коркарди nsp8|nsp9 дар полипротеини репликаи pp1a, ки тавассути Mpro ва pp1ab миёнаравӣ мешавад, таъмин карда мешавад.Дар аксари коронавирусҳо, фарқи байни ин сайти мушаххас (VKLQ|NNEI дар HCoV-229E) ва ҳама дигар маконҳои ҷудошавии Mpro коронавирус Asn аст (ба ҷои боқимондаи хурди дигар, ба монанди Ала, Сер ё Гли) P1â???Ҷойгиршавӣ (36).Маълумоти ҷудошавии пептидҳо, ки дар таҳқиқоти ибтидоӣ ба даст оварда шудаанд, нишон доданд, ки самаранокии тақсимоти сайти nsp8|nsp9 нисбат ба дигар сайтҳо пасттар буд, ки 1) ин сайти мушаххас метавонад дар коркарди саривақтии ҳамоҳангшудаи C-терминал нақши танзимкунанда дошта бошад. Минтақаи pp1a, ё 2) а Нақши nsp9 N-терминуси махсуси ҳифзшуда дар такрори вирус (37).Маълумоти мо (расми 5А) нишон дод, ки шакли рекомбинатии nsp9, ки пайдарпаии воқеии N-терминалиро дорад, аз ҷониби nsp12 самаранок NMP карда шудааст.Пайдарпаии паҳлӯи N-терминалӣ бо омили Xa (nsp9-His6; замимаи SI, Ҷадвали S1) ё ҷудошавии Mpro-миёнаравӣ (nsp7-11-His6; Расми 5А ва замимаи SI, Ҷадвали S1) хориҷ карда шуд.Муҳим он аст, ки прекурсори буриданашудаи nsp9 дорои nsp7-11-His6 ба NMPylation nsp12 муқовимат нишон дод, ки бо маълумоти мо мувофиқ аст ва нишон медиҳад, ки иловаи nsp9-NMP тавассути амини ибтидоии N-терминалӣ ба вуҷуд омадааст (замимаи SI, Расми S5) .Барои ба даст овардани фаҳмиши амиқ дар бораи хосияти субстрати NiRAN, мо сипас ба пасмондаҳои N-терминали ҳамсояи nsp9 тамаркуз кардем.Дар сурати мавҷуд набудани сафедаҳои дигар, онҳо аз ҷиҳати сохтор чандир буда, аз ошкор шудани онҳо дар шакли номбаршудаи nsp9 (26 28, 38) монеъ мешаванд, ки тағирёбии маҳдуди табиии онҳоро нишон медиҳад. вазифаи nsp9 N-терминали порчаи.Ҷойивазкунии боқимондаҳои нигоҳдошташуда дар ин минтақа (Рақмҳои 5C ва D ва замимаи SI, Тасвири S8) нишон медиҳад, ки N3826 барои NMP9 NMPylation in vitro муҳим аст, дар ҳоле ки ивазкунии N3825A ва E3827A ба коҳиши NMPylation оварда мерасонад, дар ҳоле ки M3829A ва P383 иваз намекунанд. .Аён аст, ки ба NMPylation nsp9 таъсир мерасонад.Гарчанде ки ивазкунии N-терминали Asn (N3825A, N3825S) танҳо ба NMPylation nsp9 ва репликатсияи вирус дар фарҳанги ҳуҷайра таъсири мӯътадил дорад (Расми 5C ва D), нест кардани пайдарпаии боқимондаи Asn аз дипептид N-терминали 3825-NN. исбот шудааст, ки он барои вирусҳо марговар аст, ин нишон медиҳад, ки як боқимондаи Asn пеш аз боқимондаи дигар дар N-терминус лозим аст, беҳтараш Asn, гарчанде ки ба назар чунин мерасад, ки иваз кардани пасмондаҳои шабеҳро қисман таҳаммул кардан мумкин аст (Расми 5B, C ва D).Мо ба хулосае омадем, ки дипептиди 3825-NN, махсусан боқимондаи ҳифзшуда ва муҳими N3826 дар доираи коронавирус (замимаи SI, Расми S6), пайвастшавӣ ва самти дурусти nsp9 N-терминусро дар макони фаъоли NiRAN таъмин мекунад.
Иваз кардани Ala (E3827A) ба Glu-и ҳифзшудаи ҳама зероилаҳо nsp9 NMPylation-ро дар vitro нигоҳ медорад, аммо барои вирусҳо дар фарҳанги ҳуҷайра марговар аст (Расми 5C ва D), ки вазифаи иловагии ин боқимондаро нишон медиҳад, масалан, дар робитаҳои калидӣ (NMPyted ё бетағйир). ) nsp9 N-терминус ва дигар омилҳое, ки дар такрори вирусҳо иштирок мекунанд.Мутацияҳои Nsp9 ба раванди протеолитикии nsp9 ё ягон nsps ҳамшафат таъсир нарасонданд (39) (Замимаи SI, Расми S9), ки нишон медиҳад, ки фенотипҳои марговари якчанд мутатсияҳои nsp9 мушоҳидашуда аз танзими танзими C протеолитикии минтақаи терминали pp1a ба вуҷуд наомадаанд. .
Маълумоти дар боло овардашуда далелҳо медиҳанд, ки пас аз табобати Mpro-миёнаравии макони ҷудошавии nsp8|9 дар pp1a/pp1ab, N-терминуси nsp9 метавонад UMPylated (ё қисман бо дигар NMP тағир дода шавад).Илова бар ин, нигоҳдории аълои N-терминуси nsp9 (аз ҷумла боқимондаҳои сингулярӣ ва инварианти Asn дар оилаи коронавирус) ва маълумоти генетикии баръакс, ки дар ин тадқиқот ба даст оварда шудаанд (Расмҳои 3E ва 5D) моро водор сохт, ки ба хулосае ояд, ки nsp9 NMPylation тавсифшуда аз ҷиҳати биологӣ алоқаманд аст ва барои такрори коронавирус муҳим аст.Оқибатҳои функсионалии ин тағирот бояд омӯхта шаванд, масалан, дар бораи фаъолияти қаблан тавсифшуда (ғайри мушаххас) nsp9 (шакли тағирнаёфта) РНК (2628).NMPylation N-терминал инчунин метавонад ба таъсири мутақобилаи nsp9 бо субстратҳои сафеда ё РНК ё ташаккули анҷуманҳои гуногуни чаҳорсатҳ таъсир расонад.Инҳо дар таҳқиқоти сохторӣ мушоҳида шудаанд ва тасдиқ шудаанд, ки функсионалӣ бо такрори коронавирус алоқаманданд, гарчанде ки махсусан дар сурати мавҷуд набудани ин тағирот (26- ââ29, 40).
Гарчанде ки хусусияти ҳадафи домени коронавируси NiRAN то ҳол бояд муфассалтар тавсиф карда шавад, маълумоти мо нишон медиҳад, ки хосияти ҳадафи сафедаи домени NiRAN коронавирус хеле танг аст.Гарчанде ки нигоҳдории пасмондаҳои асосии фаъоли сайт (8, 16) дар домени NiRAN-и ҳамаи оилаҳои нидовирусҳо фаъолияти сафедаҳои NMPylator-и ҳифзшударо дастгирӣ мекунанд, аммо шахсияти боқимондаҳои ҷайби субстрати ҳатмии ин домен бояд тавсиф карда шавад. , ва метавонад дар байни оилаҳои гуногуни мақсадҳои Nidovirales фарқ кунад.Ба ҳамин монанд, ҳадафҳои дахлдори дигар вирусҳои лонашуда ҳанӯз муайян карда нашудаанд.Онҳо метавонанд ортологҳои дурдасти nsp9 ё сафедаҳои дигар бошанд, зеро пайдарпаии берун аз панҷ домени реплика, ки одатан дар вирусҳои лона нигоҳ дошта мешаванд, камтар нигоҳ дошта мешаванд (8), аз ҷумла массиви геномӣ байни Mpro ва NiRAN, Дар байни онҳо, nsp9 дар корона вирус.
Илова бар ин, мо ҳоло наметавонем имкони доштани домени NiRANро истисно кунем, ки ҳадафҳои иловагӣ (аз ҷумла мобилӣ) дошта бошанд.Дар ин ҳолат, бояд қайд кард, ки гомологҳои бактериявӣ дар ин сафедаи пайдошавандаи NMPylators (NMPylators) (30, 31) ба назар чунин менамояд, ки "мустақим танзимкунанда" доранд?NMP як қатор сафедаҳои ҳуҷайраро барои танзим ё нест кардани фаъолиятҳои поёнии онҳо модул мекунад ва ба ин васила дар равандҳои гуногуни биологӣ, аз қабили вокуниши стресси ҳуҷайра ва гомеостази редокс нақш мебозад (22, 33).
Дар ин тадқиқот (Рақмҳои 2 ва 4 ва Замимаи SI, Расмҳои S3 ва S5) мо тавонистем исбот кунем, ки nsp12 қисми UMP (NMP) -ро ба як мавқеи (консерв) дар nsp9 интиқол додааст, дар ҳоле ки сафедаҳои дигар дар истифода бурда мешавад Дар шароити, мушаххаси субстрат хуб муайяншуда (ба ҷои фуҷур) дастгирӣ карда мешавад.Мувофиқи ин, дар муқоиса бо N-терминали nsp9 NMPylation, фаъолияти NMPylation-и nsp12 хеле паст аст, ошкор кардани он вақти бештари таъсири авторадиографияро талаб мекунад ва афзоиши 10 маротиба дар консентратсияи nsp12 истифода мешавад.Илова бар ин, таҳлили MS-и мо натавонист далели NMPylation аз nsp12 пешниҳод кунад, ки ин нишон медиҳад, ки худидоракунии домени NiRAN (беҳтарин) як фаъолияти дуввумдараҷа аст.Бо вуҷуди ин, бояд қайд кард, ки дигар тадқиқотҳо далелҳои пешакӣ пешниҳод карданд, ки ҳолати худидоракунии АМПилатсияи NMPylator бактериявӣ метавонад фаъолияти NMPylation онҳоро дар дигар субстратҳои сафеда назорат кунад (22, 33).Аз ин рӯ, барои таҳқиқи таъсири эҳтимолии функсионалии фаъолиятҳои худидоракунии NMPylation, ки барои EAV nsp9 (16) ва коронавирус nsp12 (ин тадқиқот) гузориш дода шудаанд, аз ҷумла таъсири пешниҳодшудаи чаперон ба қабати домени C-терминали RdRp лозим аст. 16)).
Қаблан, якчанд фарзияҳо дар бораи функсияҳои эҳтимолии поёнобии домени нидовиралии NiRAN баррасӣ шуда буданд, аз ҷумла лигаза РНК, трансферазаи сарпӯши гуанилат РНК ва фаъолияти пешбурди сафеда (16), аммо ҳеҷ кадоми онҳо бо функсияҳои мавҷудаи поёноб мувофиқ нестанд.Маълумоте, ки дар мавқеъҳои зерин ба даст оварда шудааст, бидуни тахминҳои иловагӣ маҳз ҳамон вақт аст.Маълумоте, ки дар ин таҳқиқот ба даст оварда шудааст, бештар мувофиқат мекунад (аммо исбот карда наметавонад), ки домени NiRAN дар оғози синтези РНК аз сафеда ба вуҷуд омадааст.Пештар чунин хисоб мешуд, ки вазифаи домени NiRAN дар 5??Реаксияҳои бастабандии ²-РНК ё бастабандии РНК ба инҳо таъсир намерасонанд ва Дастгирии маълумоти дигар.Аз ин рӯ, масалан, макони фаъоли NiRAN ҳамчун пойгоҳи умумӣ Asp-и консервшуда ҳисобида мешавад (D252 дар Pseudomonas syringae SelO; D4271 дар HCoV-229E pp1ab; D208 дар SARS-CoV-2 nsp12) (Замимаи SI, расми 2) ).S2) (17, 22, 33), дар ҳоле ки катализ дар лигазаи РНК-и аз ATP вобаста ва ферментҳои пӯшонидани РНК тавассути мобайнии ферментҳои ковалентӣ-(лизил-N)-NMP анҷом дода мешавад, ки боқимондаи Лис тағирнаёфтаро дар бар мегирад ( 41).Илова бар ин, хусусияти барҷастаи пайдарпайии коронавируси NiRAN барои ҳадафҳои сафедаи ҳифзшуда ва хусусияти осуда барои ко-субстратҳои NTP (бартарӣ UTP) ба ферментҳои миёнаравии NiRAN ё функсияҳои лигазаҳои РНК муқобилат мекунанд.
Аён аст, ки барои тафтиш ва агар исбот карда шавад, дар бораи нақши эҳтимолии nsp9-UMP (nsp9-NMP) дар синтези РНК-и сафеда, ки якчанд гузоришҳои ҷолиб, вале (то ҳол) қаблан гузориш шуда буданд, кори зиёде лозим аст. .Мушоҳидаҳои ҷудогона.Масалан, муайян карда шудааст, ки охири РНК-и манфии коронавирус аз риштаи олиго (U) оғоз меёбад (42, 43).Ин мушоҳида бо ақидаи он мувофиқ аст, ки синтези РНК-и манфии РНК тавассути пайваст кардани шакли UMPylated nsp9 ба думи поли(А) оғоз мешавад (триггерҳо), ки метавонад тавассути пайвастшавии РНК мусоидат кунад. Фаъолият ва/ё таъсири мутақобила бо сафедаи дигари RTC.Қисми UMP, ки аз ҷониби nsp9 пешниҳод шудааст, пас метавонад ҳамчун "праймер" барои олигуридилизатсияи миёнаравии nsp7/8/nsp12 бо истифода аз думи 3??²-поли(А) дар РНК геномӣ ё дигар пайдарпаии олиго (A) истифода шавад ҳамчун қолаб хизмат мекунад, ки ба механизме, ки барои протеини picornavirus VPg муқаррар шудааст (44).Чӣ мешавад, агар пешниҳод "ғайри меъёрӣ" бошад????Оғози синтези риштаи манфии РНК (протеин) ба мушоҳидаҳо иртибот медиҳад, ки нишон медиҳад, ки РНК-и риштаи манфии коронавирус дар охири худ UMP (ба ҷои UTP) дорад (42), ки ин нишон медиҳад, ки Кислотаи нуклеинӣ Дисер нуқтаеро, ки тавассути эндонуклеазаи номаълуми мушаххаси уридин фосфоронида шудааст, ҷудо мекунад.Агар тасдиқ карда шавад, ин фаъолияти гидролитикии кислотаи нуклеинӣ метавонад барои озод кардани шакли олигомерии UMPylated nsp9 аз охири 5 ² риштаи манфии навзод кӯмак кунад.Нақши эҳтимолии nsp9 дар пешбурди сафеда инчунин бо таҳқиқоти қаблии генетикии баръакс мувофиқ аст, ки нишон доданд, ки nsp9 (ва nsp8) бо унсури RNA-и ҳифзшудаи cis-амал дар наздикии 3 охири геноми коронавирус мутақобила мекунад.45).Тибқи ин гузориш, ин мушоҳидаҳои қаблӣ акнун метавонанд тавассути таҳқиқоти минбаъда дубора баррасӣ ва тавсеа шаванд.
Хулоса, маълумоти мо фаъолияти мушаххаси теги ферментҳои лонашудаи вирусро, ки бо RdRp дар N-терминус алоқаманд аст, муайян карданд.Дар коронавирус, ин фаъолияти нав кашфшудаи UMPylator/NMPylator тавассути NiRAN барои такя ба боқимондаҳои Mn2+ ва Asn-и шафати он истифода мешавад ва боиси ташаккули пайвандҳои фосфорамидатӣ (энергияи кам) бо амини ибтидоии N-терминалӣ мегардад.Тавассути тақсимоти миёнаравии Mpro дар макони ҷудошавии nsp8 | 9, ҳадафи nsp9 метавонад барои NMPylation истифода шавад, ки робитаи функсионалии байни протеаз ва домени NiRAN, ки то RdRp паҳн мешавад, нишон медиҳад.Нигоҳ доштани пасмондаҳои калидӣ дар макони фаъоли nsp12 NiRAN ва ҳадафи nsp9, дар якҷоягӣ бо маълумоте, ки аз ду коронавирус, аз ҷумла SARS-CoV-2 гирифта шудааст, далели қавӣ медиҳад, ки nsp9 NMPylation як коронавирус аст Хусусиятҳои консервативӣ низ як қадами калидӣ дар такрори вирус мебошанд.Маълумотҳои мавҷуда моро ба хулосае меоранд, ки нақши мушаххаси шакли NMPylated nsp9 дар синтези РНК-и сафеда як сенарияи оқилона барои коронавирус ва дигар вирусҳои лона аст ва NiRAN инчунин метавонад дигар сафедаҳои номаълумро ҳадаф қарор диҳад.Вирусро танзим кунед.Муносибати мизбон.Агар тасдиқ карда шавад, ҷалби праймерҳои сафеда дар синтези РНК вирусӣ наздикии пайдарпайии доменҳои Mpro/3CLpro ва RdRpро дар байни супергурӯҳҳои қаблан ошкоршудаи коронавирус ва пикорнавирус монанд (9), ки ҳоло дар Писонивиритҳои ба наздикӣ таъсисёфта муттаҳид шудаанд, зиёд мекунад. 46) дар категория.
Маълумоти мо инчунин нишон медиҳад, ки фаъолиятҳои ферментҳои асосӣ, интихобӣ ва консервативии дар ин таҳқиқот муайяншуда метавонанд ҳамчун ҳадаф барои доруҳои зидди вирусӣ истифода шаванд.Пайвастҳое, ки ба пайвастшавӣ (ва тағир додани минбаъда)-и nsp9 N-терминуси ҳифзшуда дар макони фаъоли NiRAN халал мерасонанд, метавонанд ба доруҳои антивирусии муассир ва бисёрҷониба таҳия карда шаванд, ки барои муолиҷаи коронавирусҳои ҳайвонот ва одам аз сироятҳои гуногун (зер) ҷинс мувофиқанд. , аз ҷумла SARS-CoV-2 ва Синдроми роҳи нафасии Шарқи Наздик.
пайдарпаии рамзгузории протеини коронавирус, ки дар ин тадқиқот истеҳсол шудааст, тавассути RT-PCR бо истифода аз РНК ҷудошуда аз Huh-7, ки бо HCoV-229E ё Vero E6 сироят ёфтааст, бо SARS-CoV-2 васеъ карда шуд ва бо истифода аз расмиёти стандартии клонкунӣ ворид карда шуд.pMAL-c2 (Лабораторияи биологии Англия) ё вектори ифодаи pASK3-Ub-CHis6 (47) (Замимаи SI, Ҷадвалҳои S1 ва S2).Ҷойивазкунии кодонҳои ягона тавассути мутагенези ба макон нигаронидашудаи ПЗР ҷорӣ карда шуданд (48).Барои тавлиди протеини меъмории MBP, ҳуҷайраҳои E. coli TB1 бо сохтори мувофиқи плазми pMAL-c2 табдил дода шуданд (замимаи SI, Ҷадвали S1).Протеини синтез бо хроматографияи наздикии амилоза тоза карда шуд ва бо фактор Xa ҷудо карда шуд.Баъдан, сафедаи C-терминали Ҳис6-тагеки бо хроматографияи наздикии металлии Ni-иммобилизатсияшуда (Ni-IMAC) тавре ки қаблан тавсиф шуда буд, тоза карда шуд (49).Барои тавлиди протеини синтези ubiquitin, ҳуҷайраҳои E. coli TB1 сохтори плазмиди мувофиқи pASK3-Ub-CHis6 (Замимаи SI, Ҷадвалҳои S1 ва S2) ва pCGI плазмиди ДНК-ро, ки гидролазаи хоси C-терминали гидролазаи 1 (Ubp1) рамзгузорӣ мекунад, истифода бурданд.Трансформатсия (47).Протеини коронавируси C-терминали Ҳис6 нишон додашуда тавре, ки қаблан тавсиф шуда буд, тоза карда шуд (50).
Санҷиши худидоракунии NMPylation HCoV-229E nsp12-His6 тавре анҷом дода шудааст, ки дар EAV nsp9 (16) тавсиф карда шудааст.Хулоса, nsp12-His6 (0,5 мкМ) дорои 50 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)-KOH, pH 8,0, 5 mM dithiothreitol (DTT), 6 mM MnCl2, buff2er, NTP муайяншуда ва 0,17 μM [α32-P]NTP (3,000 Ci/mmol; Hartmann Analytic) дар 30 °C барои 30 дақиқа мувофиқат карданд.Дар ҳама дигар таҳлилҳои (стандартӣ) NMPylation nsp12 миёнаравӣ NMPylation, шароити реаксия ба таври зерин тасҳеҳ карда мешавад: nsp12-His6 (0,05 μM) ва nsp9-His6 (4 μM) дар ҳузури 50 mM HEPES-KOH (pH 8.0) ), 5 mM DTT, 1 mM MnCl2, 25 μM NTP-ро нишон медиҳад ва 0,17 μM ба [α32-P]NTP мувофиқат мекунад.Пас аз инкубатсия барои 10 дақиқа дар 30°C, намунаи реаксия бо буфери намунаи SDS-PAGE омехта карда шуд: 62,5 мм трис(гидроксиметил)аминометан HCl (pH 6,8), 100 мм DTT, 2,5% SDS, 10% глицерол ва 0,05% бромол. кабуд.Сафеда бо гарм кардани 90 °C барои 5 дақиқа денатурат карда шуд ва бо 12% SDS-PAGE ҷудо карда шуд.Гель собит ва бо маҳлули Coomassie Brilliant Blue (40% метанол, 10% кислотаи сирко, 0,05% Coomassie Brilliant Blue R-250) ранг карда, ранг карда мешавад ва дар тӯли 20 соат дар экрани фотографии фосфоресентӣ (барои муайян кардани nsp12 аз NMPy) дучор мешавад. ё (максимум) 2 соат (барои арзёбии nsp9 NMPylation).Барои скан кардани экран як тасвиргари Typhoon 9200 (GE Healthcare) ва ImageJ барои таҳлили шиддати сигнал истифода шуд.
Барои таҳлили MS, 1 μM nsp12-His6 ва 10 μM nsp9 (бе теги гексахистидин) дар таҳлили NMPylation (замимаи SI, Ҷадвали S1) ва консентратсияи афзояндаи 500 μM UTP ва GTP истифода шудааст.Вобаста аз консентратсияи онҳо ва сифати сафедаи пешбинишаванда, системаи Waters ACQUITY H-Class HPLC, ки бо сутуни MassPrep (Обҳо) муҷаҳҳаз шудааст, барои аз 1 то 10 мкл маҳлулҳои сафедаи буферӣ дар онлайн тоза карда шуд.Протеини намакзада ба манбаи ионҳои электроспрейи масс-спектрометри Synapt G2Si (Обҳо) тавассути градиенти зерини буфери А (об/0,05% кислотаи формик) ва буфери В (ацетонитрил/0,045% кислотаи формикӣ) элюта мешавад ва ҳарорати сутун аст. 60 ° C ва суръати ҷараёни 0,1 мл/дақ: элюсия ба таври изократикӣ бо 5% A барои 2 дақиқа, баъд градиенти хатӣ то 95% B дар давоми 8 дақиқа ва 95% B барои 4 дақиқаи дигар нигоҳ доред.
Ионҳои мусбат бо диапазони массаашон аз 500 то 5000 м/з муайян карда мешаванд.Глю-фибринопептид B ҳар 45 сония барои ислоҳи автоматии дрейфи масса чен карда мешавад.Нармафзори асбоби MassLynx-ро бо тамдиди MaxEnt1 истифода баред, то спектри миёнаро пас аз тарҳ кардани хатти асосӣ ва ҳамвор созед.
UMPylated HCoV-229E nsp9 бо илова кардани трипсин дар дараҷаи пайдарпай тағирёфта (Серва) ҳазм карда шуд ва дар як шабонарӯз дар 37 °C инкубатсия карда шуд.Як сутуни чархзании Chromabond C18WP (рақами қисми 730522; Macherey-Nagel) барои тоза кардан ва консентратсияи пептидҳо истифода шуд.Ниҳоят, пептид дар 25 мкл об, ки дар таркибаш 5% ацетонитрил ва 0,1% кислотаи формикӣ мавҷуд буд, гудохта шуд.
Намунаҳо аз ҷониби MS бо истифода аз масс-спектрометри Orbitrap Velos Pro (Thermo Scientific) таҳлил карда шуданд.Системаи ниҳоии nanoâ HPLC (Dionex), ки бо 50 см васлшудаи фармоишӣ муҷаҳҳаз шудааст?Сутуни 75 мкм C18 RP бо маҳтобҳои магнитии 2,4 мкм печонида шудааст (Доктор Албин Maisch High Performance LC GmbH) Ба спектрометри масса тавассути манбаи nanospray Proxeon онлайн пайваст шавед;6 мкл маҳлули ҳозимаи трипсинро ба диаметри дарунии 300 мкм ворид кунед ×??1 см C18 PepMap сутуни консентратсияи пешакӣ (Thermo Scientific).Бо истифода аз об/0,05% кислотаи формикӣ ҳамчун ҳалкунанда, намуна ба таври худкор банд карда шуд ва бо суръати ҷараёни 6 мкЛ/дақ шӯр карда шуд.
Барои ноил шудан ба ҷудошавии пептидҳои триптӣ бо суръати ҷараёни 300 нЛ/дақ градиентҳои зерини об/0,05% кислотаи формикӣ (ҳалкунандаи А) ва 80% ацетонитрил/0,045% кислотаи формикӣ (ҳалкунандаи В) истифода шуданд: 4% B барои 5 дақиқа, баъд 30 A градиенти хатӣ ба 45% B дар давоми дақиқаҳо ва афзоиши хатӣ то 95% ҳалкунанда B дар давоми 5 дақиқа.Сутуни хроматографиро ба нано-эмиттери аз пӯлоди зангногир пайваст кунед (Proxeon) ва элюентро мустақиман ба капилляри тафсоншудаи спектрометри масса бо истифода аз потенсиали 2300 В пошед. Скани пурсиш бо қарори 60 000 дар анализатори массаи Orbitrap алоқаманд аст. бо ҳадди ақал се маълумот сканҳои MS/MS, ки динамикӣ дар давоми 30 сония хориҷ карда шудаанд, бо истифода аз бархӯрди доми ионҳои хатӣ ё диссотсиатсияи бархӯрди энергияи баландтар дар якҷоягӣ бо муайянкунии орбитрап, Ҳалнома 7,500 аст.
Вақти интишор: 03-03-2021